SEL-SEL T HELPER YANG MENSEKRESI SITOKIN TIPE 1 DAN 2 PADA PASIEN DENGAN STOMATITIS APHTOUS REKUREN

Stomatitis aphtous rekuren (RAS) adalah salah satu penyakit ulseratif yang paling sering ada. Meskipun kondisi ini telah digambarkan oleh hipokrates pada tahun 360 SM, namun belum ada etiologi RAS yang jelas. Faktor-faktor pemicu antara lain trauma, stress, iritasi kimia, hormon, jenis makanan tertentu dan hereditas. Stres emosional dan fisik telah diimplikasikan dalam patogenesa RAS. Defisiensi zat besi, folat dan vitamin B-12 juga dicatat dalam hubungannya dengan penyakit ini.






Gambar 1. gambaran RAS
Patogenesa RAS juga melibatkan suatu vaskulitis yang dimediasi immun kompleks. Autoantibodi terhadap membrane mukosa oral telah dinyatakan sebagai gambaran histopatologisnya. Suatu infiltrasi sel limfotik dalam epithelium pada tahap awal penyakit diikuti oleh pembengkakan papula terlokalisir akibat vakuolisasi keratinosit yang dikelilingi oleh suatu eritematosa menghasilkan vaskulitis. Papula yang nyeri kemudian berulser, yang utamanya diinfiltrasi oleh neutrofil, limfosit dan sel-sel plasma. Akhirnya, terjadi penyembuhan dengan regenerasi epitel.


Sitokin adalah mediator utama respon imun terhadap mikroorganisme, tumor dan antigen sendiri. Sitokin merupakan fokus utama pada penelitian patogenesa respon imun. Sitokin diproduksi oleh beragam jenis sel dalam darah termasuk sel-sel T helper tipe 1 dan 2. Umumnya kedua jenis ini disekresikan dari sel T helper; Tipe 1 (interleukin [IL]-2, IL-12, interferon [INF]-, dan tumor necrosis factor [TNF]-) yang dianggap sebagai sitokin pro inflamasi yang menginduksi immunitas dan Tipe 2 (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 dan IL-13) yang juga sitokin antiinflamasi yang mengawali immunitas dan toleransi humoral. Profil sitokin merupakan hal krusial dalam penentuan toleransi dan aktivasi imun.







Gambar 2 . Sel T helper
Tujuan penelitian ini adalah untuk mendeteksi, mengenumerasi dan mengkarakterisasi sel-sel T helper yang mensekresi sitokin tipe 1 dan 2 (IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-, dan TNF-) pada darah tepi pasien RAS.
Bahan dan Metode
Pasien dan sampel
Sebanyak tiga puluh (30) pasien dengan RAS minor dalam fase aktif penyakit (14 pria dan 18 wanita, usia rata-rata 35,4±12,03 rentang 19-56 tahun) yang tidak memiliki penyakit sistemik atau penyakit inflamasi lainnya dan 40 orang sehat, dipasangkan sesuai umur dan jenis kelamin kelompok RAS (Tabel 1) dipilih dari penelitian ini. Semua pasien dengan RAS dan kontrol direkrut dari klinik Penyakit Mulut. Semua pasien adalah bukan perokok dan mengalami lesi aphtous minor setiap bulan sepanjang tahun terakhir sebelum penelitian dilakukan. Pasien tidak menerima perawatan apapun dan lesinya sembuh secara spontan. Penelitian ini dilakukan dengan memenuhi aturan relevan dan khususnya sesuai dengan deklarasi Helsinki.
Tabel 1. Jenis kelamin dan usia pasien dan kelompok kontrol
Laki-laki Perempuan Total Rata-rata usia (tahun)
Jumlah pasien 14 18 32 35,4±12,03
Jumlah kontrol 18 22 40 31,7±13,06

Isolasi dan kultur PBMC
Darah perifer diambil dari semua pasien dan kontrol. Sel-sel mononuclear darah perifer (PBMC) diisolasi dari darah yang telah diheparinisasi dengan saline fosfat buffer (PBS, 1:1) dan setelah itu disentrifugasi pada larutan pemisah Ficoll-Hypaque (Biochrom AG, Berlin, Jerman). Setelah tiga pencucian dengan PBS, viabilitas PBMC yang ditentukan oleh eksklusi biru tripan adalah 97%.

Pengujian enzyme-linked immunospot (ELISPOT)
Pengujian ELISPOT adalah alat pengujian yang fleksibel dan sangat sensitive untuk menganalisa sekresi immunologis dari darah perifer dan populasi sel limfoid. Proses ini memungkinkan deteksi, enumerasi, dan karakterisasi dari sel-sel pensekresi sitokin individual dalam populasi sel yang telah dikultur.




GAMBAR 3. CAWAN elispot
Cawan Elispot merupakan cawan Microtiter 96-well dengan filter membrane nitroselulose pada setiap cawan.
Langkah 1: Secara asepsis cawan-cawan dilapisi dengan antibody anti- IFN-, anti IL-2, anti IL-4, anti IL 5, anti Il-6, anti IL-10, anti IL-12 atau anti- TNF- yang dilarutkan dalam PBS pH 7,4 pada konsentrasi 5µg/ml (100 µl per well) dan dinkubasi semalam pada suhu kamar.
Langkah 2: Cawan dibilas tiga kali dengan PBS pH 7,4 dan diblok dengan 200µl RPMI 1,640 + 10% fetal calf sercem (FCS).
Langkah 3: Suspensi PBMC yang ada, pada rentang konsentrasi antara 1 x 105 – 5 x 104 per well disiapkan pada well yang lain selama semalam pada incubator CO2 5% suhu 370 C dan kelembaban 90%.
Langkah 4: Suspensi PBMC ditambahkan pada well yang telah diblok dengan RPMI dan diinkubasi dalam CO2 5% pada suhu 370 C selama 1 jam. Pada periode ini, antigen spesifik merespon sel-sel yang mensekresi sitokin.
Langkah 5: Cawan dicuci dengan PBS-T20 yang mengandung 1% FCS
Langkah 6: Cawan dicuci kemudian diinkubasi dengan antibody yang telah dibiotinilasi anti mouse IFN-, anti IL-2, anti IL-4, anti IL 5, anti Il-6, anti IL-10, anti IL-12 atau anti- TNF- pada konsentrasi 5µg/ml (suhu kamar selama satu malam) dan kemudian dicuci tiga kali dengan PBS-T20.
Langkah 7: Larutan avidin-peroxidase (Sigma-Aldrich Corporation, St Louis, MO, USA) pada konsentrasi 1:1.000 dalam PBS-T20 1% FCS ditambahkan ke well dan dinkubasi selama 2 jam pada suhu kamar.
Setelah inkubasi, muncul titik-titik pada semua sel-sel yang merespon. Titik-titik yang terbentuk ditambahkan dengan 3-amino-9-ethylcarbazole dan hydrogen peroksidase dan jumlahnya dihitung dibawah mikroskop stereostopik. Jumlah sel-sel pembentuk titik dinyatakan dalam per 106 sel.
Analisa statistic
Uji Student T-test dilakukan untuk mengetahui kemaknaan beda rata-rata sel-sel T helper tipe 1 dan 2 pada kelompok pasien dan kontrol.
Hasil
Jumlah sel-sel T helper yang mensekresi IL-2, IL-12, dan IFN- meningkat pada darah perifer pasein RAS dibandingkan kelompok kontrol yang sehat (p < 0,05, p < 0,001, dan p < 0,001, secara beurutan). Tidak terdapat perbedaan statistik yang teramati dalam jumlah sel-sel pensekresi TNF- antara pasein RAS dan kelompok kontrol (p > 0.05) (Tabel 2).
Jumlah sel-sel T helper tipe 2 yang mensekresi IL-10 juga meningkat pada pasien RAS (p < 0.05) (Tabel 3). Jumlah sel-sel pensekresi IL-4 pada pasien dengan RAS mengalami penurunan dibanding kelompok kontrol (p < 0.001), sementara tidak terdapat perbedaan statistic jumlah sel-sel pensekresi IL-5 dan IL-6 antara pasien RAS dan kontrol (masing-masing nilai p >0.05) (Tabel 3).
Tabel 2. Jumlah sel-sel T helper yang mensekresi sitokin tipe 1 pada pasien RAS dan kontrol
Jumlah sel-sel T helper tipe 2 pada pasien RAS Jumlah sel-sel T helper tipe 2 pada kelompok kontrol p
sel-sel pensekresi IFN- 128,5±13 59,3±14 p < 0.001
sel-sel pensekresi IL-2 98,6±7,3 49,7±5,7 p < 0.05
sel-sel pensekresi IL-12 200,2±2,9 80,9±1,3 p < 0.001
sel-sel pensekresi TNF- 184±16 177,6±16 p > 0.05

Tabel 3. Jumlah sel-sel T helper yang mensekresi sitokin tipe 2 pada pasien RAS dan kontrol
Jumlah sel-sel T helper tipe 2 pada pasien RAS Jumlah sel-sel T helper tipe 2 pada kelompok kontrol p
sel-sel pensekresi IL-4 50,81±0,88 120,1±1,6 p < 0.05
sel-sel pensekresi IL-5 60,63±0,88 80,82±0,99 p > 0.05
sel-sel pensekresi IL-6 84,1±11 80,4±8,5 p > 0.05
sel-sel pensekresi IL-10 297±41 193±29 p < 0.05

Pembahasan
Sistem imun kita memiliki sifat pertahanan penting terhadap benda-benda asing. Hal ini dicapai dengan kemampuannya untuk mengenali antigen-antigen asing dan untuk mencegah aksi merusak sebagaimana halnya dengan respon imun yang menghancurkan diri sendiri. Karena hal tersebut, tidak terdapat perbedaan antara benda asing dan autoantigen, beberapa ahli menyatakan bahwa sel-sel system imun bereaksi terhadap antigen hanya dengan adanya sitokin.






gambar 4. SEl T bekerja pada pathogen
Dalam penelitian ini, kami meneliti parameter reaksi imun yang biasa terlibat dalam patogenesa RAS. Kami mendeteksi, mengenumerasi dan mengkarakterisasi sel T helper tipe 1 dan 2 dan secara langsung kami meneliti kemampuannya dalam mensekresi sitokin-sitokin tertentu (IFN-,IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, dan IL-10). Kami percaya bahwa determinasi kapasitas sel-sel T helper tipe 1 dan 2 untuk produksi sitokin merupakan metode yang lebih handal dibanding dengan pengukuran sitokin dalam serum. Hasil penelitian kami menunjukan peningkatan secara statsistik jumlah sel-sel T helper tipe 1 (sel-sel pensekresi IL-2, IL-12, IFN-) dibandingkan kelompok kontrol (p < 0,05, p < 0,001, dan p < 0,001, secara beurutan). Temuan yang sama juga dilaporkan dalam penelitian-penelitian lain. Buno dan kawan-kawan (1998) yang menggunakan metode RT-PCR melaporkan bahwa jumlah serum IFN-, TNF-, IL-2 dan IL-4 meningkat pada pasien RAS, sementara jumlah IL-10 sama dengan kelompok kontrol yang sehat. Hal yang sama, Borra dan kawan-kawan (2004) yang menggunakan analisa DNA menunjukkan bahwa ekspresi sitokin tipe 1 pada pasien RAS secara statistic meningkat dibanding kelompok kontrol.
Meskipun sifat patogenetik TNF- telah dibahas dalam literatur, hasil yang kami peroleh tidak menunjukkan adanya perbedaan statistic TNF- antara pasien RAS dan kelompok kontrol ( p > 0.005). TNF- telah dianggap menginduksi inflamasi dengan efeknya pada adesi sel endotel dan kemotaksis neutrofil. Peningkatan jumlah serum TNF- dari PBMC terstimulasi pada pasien RAS telaporkan dalam beberapa penelitian.
Sebaliknya, jumlah sel-sel Thelper tipe 2 tertentu , misalnya sel-sel yang memproduksi IL-4 yang antagonis produksi sitokin tipe 2 ditemukan menurun secara statistic dibandingkan dengan kelompok kontrol (p < 0.005). Tidak terdapat perbedaan signifikan dalam jumlah sel-sel pensekresi IL-5 dan IL-6 antar pasien RAS dan kelompok kontrol ( p > 0.005).
Semua temuan ini menunjukkan sifat dominant sitokin-sitokin proinflamasi (sel T helper tipe 1) dalam tingkat lesi dan darah perifer pasien RAS. Hal ini mungkin signfikan bagi patogenesa RAS.
Sifat respon imun dan profil imun dalam RAS, mengindikasikan tipe respon imun yang dimediasi sitokin tipe 1. Peningkatan ekspresi sitokin proinflamasi (TNF-, IFN- dan IL-6) pada RAS juga dapat disebabkan oleh pematangan epitel oral sel-sel Langerhan dan akibat dari lanjutan dari aktivasi sel-sel T. Penghancuran jaringan dijelaskan dengan adanya fakta bahwa RAS mungkin potensial mengaktifkan sel-sel sitotoksik yang dapat menyebabkan munculnya lesi pada tempat tertentu.
Sebagai kesimpulan, hasil penelitian kami menunjukkan peningkatan sel-sel T helper pensekresi sitokin tipe 1. Dengan memperhatikan luas dan pentingnya peranan sel-sel T helper dalam system imun, kami menyatakan bahwa sel-sel ini dapat mempengaruhi respon imun terhadap RAS. Apakah aksi ini merupakan etiologi atau reaktif penting pada kerusakan ulseratif mukosa oral adalah suatu pertanyaan yang perlu dijawab.